Святой Тимофей родился в начале I века в городе Листры в римской провинции Анатолия (современная Турция).
Когда апостол Павел в своем миссионерском путешествии проповедовал Евангелие в этом городе и сделал чудо, вылечив больного от рождения, многие листрийцы уверовали в истинного Бога. Среди них была и одна иудейка. Она пригласила апостола домой и поручила ему сына Тимофея, умоляя взять его на воспитание. С тех пор Тимофей стал не только верным спутником и соработником Павла, но и любимым учеником. Вместе они трудились, страдали от преследований, посещали греческие и малоазийские города, где ревностно благовествовали. Когда апостола заключили в Риме и обрекли на казнь, именно Тимофея он вызвал на последнюю встречу перед смертью.
В каноне Новозаветных книг содержаться два послания Павла к Тимофею, наполненных словами любви и мудрыми наставлениями. «Ты последовал мне в учении, жизни, привязанности, вере, любви, терпении, — писал он. — Терпи трудности, как хороший воин Иисуса Христа». Кроме того имя Тимофея указывается в начале нескольких других Павловых посланий, указывая предположительно на то, что Тимофей записывал их со слов своего учителя.
Впоследствии апостол Павел поставил Тимофея первым епископом древнего малоазийского города Эфес. Здесь же около 80 года (по другой версии в 97-м) он отошел к Богу, претерпев мученичество. Когда епископ пытался остановить шествие в честь богини Дианы, проповедуя Евангелие, разгневанные язычники избили его, потащили по улицам и забили до смерти.
Мощи святителя в IV веке были перевезены в константинопольскую церковь святых апостолов возле гробниц святого Андрея и святого Луки. В 1204 году крестоносцы перенесли мощи в итальянский город Термоли, где они до сих пор хранятся в соборе Божией Матери. Небольшие части мощей также находятся в Николаевском монастыре в Форт-Майерсе (Флорида, США) и Казанском соборе Элисты (Россия).
Память апостола Тимофея Православная Церковь совершает 4 февраля.